超敏版人腫瘤壞死因子α(TNF-α) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒

腫瘤壞死因子α（ TNF-α) 簡(jiǎn)介：

腫瘤壞死因子α（ TNF-α)  由中性粒細(xì)胞、活化的淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、NK    細(xì)胞、LAK細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生。 小鼠TNF-α以膜錨定的形式出現(xiàn)。 自然發(fā)生的TNF-α形式是糖基化的 ，但非   糖基化的重組TNF-α具有相當(dāng)?shù)纳锘钚?。人類和鼠類的TNF-α在氨基酸水   平上顯示出大約79%的同源性。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） 。往預(yù)先包被有人 腫瘤壞死因子α(TNF-α)捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo) 記的檢測(cè)抗體 ，HRP酶結(jié)合物 ， 中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌 ， 用底物TMB顯色 ， TMB在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色 ，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的 黃色。顏色的深淺和樣本中的人腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm  波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值） ，計(jì)算樣本濃度。

靈敏度：7.65pg/mL

特異性：可檢測(cè)樣本中人的TNF-α ,  且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

檢測(cè)范圍： 15.62-1000pg/mL

樣本稀釋：

請(qǐng)?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測(cè)樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 100 倍稀釋；

稀釋 1000 倍 ：兩步稀釋。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 20 倍稀釋 ， 再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ， 做 50 倍稀釋 ， 總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 40 倍稀 釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，最后取 5 μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 100000 倍；每步稀釋時(shí)取液量不少于 3μL ，稀釋倍數(shù)不超過(guò) 100 倍。每步稀釋都需混合均 勻 ，避免起泡。

1.    從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩余板條用自封袋密封 放回4℃。

2.    加樣 ：分別將樣本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μL每孔加入相應(yīng)孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：

將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。從而減   少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響 ，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋 倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3.    加生物素化檢抗 ：取出酶標(biāo)板 ，棄去液體 ，不用洗滌。每孔直接加入

100μL生物素化檢抗工作液 ，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。

4.    洗板 ：棄去液體 ，每孔加入300μL 1x洗滌液 ，靜置1分鐘 ，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干 ，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5.    加酶結(jié)合物工作液 ：每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液 ，蓋上封板膜后 37℃溫育30分鐘。

6.    洗板 ：棄去液體按步驟4洗滌方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，蓋上封板膜 ，37℃避光溫育15分鐘。

8.    加終止液 ：取出酶標(biāo)板 ，每孔直接加入50μL終止液 ，立即在450nm波長(zhǎng) 處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1.    計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均  OD  值并減去空白孔的  OD  值作為校 正值。 以濃度為橫坐標(biāo) ，OD  值為縱坐標(biāo) ，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參 數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.    若樣本 OD  值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限 ，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度 時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考 ，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意 ：本圖僅供參考 ，應(yīng)以每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

1.    重復(fù)性 ：板內(nèi)變異系數(shù)小于  10% ，板間變異系數(shù)小于  10%。

2.    回收率 ：在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入  3  個(gè)不同 濃度水平的人TNF-α ,  計(jì)算回收率。

3.    線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入

高濃度人TNF-α ,  在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋 ，評(píng)估線性。